基因敲除细胞株（KO）
基因敲除细胞株（KO）构建服务，基于 CRISPR/Cas9。
基因敲除细胞株（KO）构建
基因敲除细胞株（Knockout, KO）是利用 CRISPR/Cas9 系统在基因组上靶向切割目的基因、通过非同源末端连接（NHEJ）修复引入移码突变或大片段删除，使该基因完全丧失功能的细胞系，是研究基因功能、构建疾病模型、验证药物靶点的关键工具，相比 RNAi 具有彻底、稳定、可遗传的优势。
维而勤提供从 sgRNA 设计、Cas9-sgRNA 载体构建、细胞转染（电转 / 脂质体）、单克隆分离（有限稀释法）到敲除验证的全流程 KO 株构建服务。支持移码突变（单 sgRNA + NHEJ）与大片段删除（双 sgRNA）两种敲除策略，配套 Sanger 测序（基因型层面）与 Western Blot（蛋白层面）双重验证，可交付多克隆细胞池（Pool）与纯合敲除单克隆（Monoclonal）两种形式。
敲除策略对比
移码突变（Indels）
单 sgRNA + NHEJ，经典方案
- 原理：单条 sgRNA 引导 Cas9 切割外显子，NHEJ 修复引入 InDels
- 插入/缺失导致移码突变，蛋白翻译提前终止
- 验证：Sanger 测序确认突变 + Western Blot 验证蛋白缺失
- 优势：设计简单、周期短，适合多数常规敲除需求
大片段删除
双 sgRNA，彻底敲除
- 原理：设计两条 sgRNA 靶向基因两侧，切除整段外显子或关键结构域
- 删除片段可达数 kb，彻底去除蛋白编码区，避免回补或可变剪接绕过
- 验证：PCR 鉴定删除片段大小 + Sanger 测序确认断点
- 优势：适合长基因、移码易被可变剪接绕过、需彻底敲除的项目
订购信息
支持 CRISPR/Cas9 移码突变与大片段删除两种策略，可交付 Pool 或 Monoclonal。
| 目录号 | 服务项目 | 交付形式 | 验证方法 | 生产时间 |
|---|---|---|---|---|
| CX901 | 基因敲除细胞株 Pool（多克隆混合池） | Pool | Sanger 测序（pool 峰图） | 8-11 周 |
| CX902 | 基因敲除细胞株 Monoclonal（单克隆） | 2-3 株纯合敲除单克隆 | Sanger 测序 + Western Blot | 16-24 周 |
| CX903 | sgRNA 设计与 Cas9 载体构建 | 2-3 条 sgRNA 载体 | 测序验证载体 | 2-3 周 |
| CX904 | 单克隆敲除验证（测序 + WB） | — | Sanger + Western Blot | 2-3 周 |
| CX905 | 大片段删除敲除（双 sgRNA） | 2-3 株单克隆 | PCR + Sanger + WB | 咨询 |
价格根据基因长度、敲除策略与细胞类型询价立即询价 →
交付内容
交付纯合敲除单克隆细胞株与完整验证报告，确保基因型正确、蛋白彻底缺失、无污染。
| 交付项目 | 内容说明 |
|---|---|
| KO 细胞株 | 2-3 株纯合敲除单克隆冻存管（≥ 1×10⁶ cells/vial） |
| 测序验证图谱 | Sanger 测序峰图与序列比对（确认移码或片段删除） |
| Western Blot 图 | 目的蛋白 Western Blot 验证图（确认蛋白缺失） |
| sgRNA 序列 | sgRNA 靶向序列与载体图谱 |
| 细胞冻存与说明 | 冻存管 + 培养说明 + 支原体检测报告 |
以上为参考交付范围，具体交付内容以双方确认的实验方案为准，详情请咨询技术支持。
质控标准
KO 株构建全流程质控：
✓sgRNA 设计
方法：在线工具（Benchling / CRISPOR）设计 + 脱靶评估
标准：常规设计 2-3 条 sgRNA，靶向功能外显子，评分 ≥ 60
✓转染效率
方法：电转 / 脂质体转染（含 GFP 报告）
标准：转染后 48 h 荧光阳性率 ≥ 50%
✓单克隆化
方法：有限稀释法（96 孔板单细胞接种）
标准：单克隆来源单一，无混合
✓基因型验证
方法：Sanger 测序 + 序列比对
标准：确认纯合移码突变或大片段删除
✓蛋白验证
方法：Western Blot
标准：目的蛋白条带完全缺失
✓支原体检测
方法：PCR 法 / 荧光染色法
标准：阴性
服务保证
关键参数
交付 2-3 株纯合敲除单克隆
常规项目交付 2-3 株经 Sanger 测序与 Western Blot 双重验证的纯合敲除单克隆。sgRNA 常规设计 2-3 条，移码突变与片段删除两种策略可选。覆盖 HEK293T、HeLa、A549、HepG2、MDA-MB-231 等常用肿瘤细胞系，难转染细胞可定制电转方案。
⚠️以下情形需注意
- •目的基因为必需基因（essential gene）敲除致死，单克隆无法建系
- •目的基因大片段删除涉及复杂结构域，敲除效率偏低
- •难转染细胞（如某些原代细胞、悬浮细胞）转染效率低，单克隆得率少
- •Cas9 脱靶效应可能导致非预期突变，重要项目建议做脱靶预测与验证
- •客户提供细胞系的质量不达标（污染、代次过老、STR 不匹配）
客户提供
委托维而勤前请按以下清单准备材料：
- ✓提供目的基因名称、物种、基因 ID（NCBI Gene ID / Ensembl ID）
- ✓提供目的细胞株名称、来源、代次、培养基配方与培养条件
- ✓明确敲除策略偏好：移码突变（单 sgRNA）/ 大片段删除（双 sgRNA）
- ✓明确交付形式：Pool（周期短）或 Monoclonal 单克隆（周期长但纯度高）
- ✓明确验证要求：Sanger 测序 + Western Blot（推荐）；如需抗体请提供信息或委托维而勤采购
- ✓如细胞为稀有或客户自有细胞株，需提前提供足够数量且无支原体污染
必需基因（essential gene）敲除后细胞无法存活，建议改用条件性敲除（floxed + Cre）或 KD 方案；难转染细胞建议提前做转染条件优化（电转参数、Cas9 RNP 复合物），避免单克隆得率过低导致项目延期。
交付周期
标准交付周期
Pool 8-11 周 / Monoclonal 16-24 周
从确认 sgRNA 方案与收到合格细胞次日起算；难转染细胞、单克隆筛失败需重筛、大片段删除效率偏低的项目可能延长；现货 KO 细胞库（部分常用基因）可快至 1 周发货，以合同为准。
本页内容为一般性介绍，实际交付物、规格与周期以双方确认的实验方案及合同为准，详情请咨询技术支持。